Prevalence of Brucella Melitensis and Brucella Abortus in Raw Milk and Dairy Product by Real Time PCR Technique

مقدمة

(بروسليس) مرض زونوي واسع الانتشار لكل من البشر والحيوانات الحيوانية المرتبطة بالعدوى من قبل أنواع بروسلا (1)- يسبب هذا المرض في الإنسان الحمى، والمرض، والذباب، ويمكن أن يؤدي في وقت لاحق إلى أمراض غير دقيقة أو مزمنة تؤثر على مختلف الأنسجة والأعضاء (2)In animals, causes abortion, fetal death, and genital infections (3)ومن بين الأنواع الستة لبروسلا التي تم تحديدها حاليا، يُعتبر B.melitensis و B.abortus من المحتمل أن يكونا مسببين للأمراض لدى البشر. (4)B.melitensis and B.abortus can infect most domestic animals (e.g. goat, sheep and cattle). يحدث الانتقال إلى البشر عن طريق الاتصال المباشر وغير المباشر بالحيوانات المصابة أو عن طريق استهلاك الحليب أو منتجات الحليب الملوثة مثل اليوغرت والآيس كريم (5, 6)إن مشكلة الصحة العامة مرتفعة، واستهلاك الحليب الخام هو السبب الرئيسي في الحصول على الفرشاة. (7)- في العقود الأخيرة، تغيرت ظاهرة الأوبئة الناجمة عن الكدمات البشرية تغيرا شديدا بسبب الأسباب الاجتماعية - الاقتصادية أو السياسية واختلاف الحالة الصحية (2)- في حين يجري تطبيق برامج القضاء في معظم البلدان المتقدمة النمو مثل أوروبا وأستراليا وكندا واليابان ونيوزيلندا، فإن هذه البرامج لا تزال تمثل مشكلة صحية هامة، لا سيما في البلدان النامية. (4, 8).

وقد برزت بروسلوسيس بصفة خاصة في آسيا الوسطى ولا تزال منتشرة للغاية في حوض البحر الأبيض المتوسط، وسوريا، والمملكة العربية السعودية، ومصر، وليبيا، وإيران (8–10)إيران منطقة متوطنة للدماغ (11)- بلغت معدلات انتشار البلازما في بلدنا في حليب الحيوانات في عامي 1980 و 1991 6.4 في المائة و 10.18 في المائة على التوالي. (12)- درست دراسة مماثلة سابقة أجريت في أورميا الحليب للأجسام المضادة للدماغ ب. وخلصت نتائجها إلى أن انتشار الداء في الماشية منخفض (حوالي 1.2 في المائة في فصلي الخريف والربيع) في هذه المنطقة (9)وأظهرت مختلف الدراسات الأخرى التي أجريت مؤخرا في عدة أجزاء من إيران مثل هذا الشهيركورد (29.8 في المائة) وشرق أزاربايانسابار (2.2 في المائة) ومدينة خوي القريبة من الأورميا (حوالي 29.7 في المائة في ربيع 2008) انتشارا مختلفا في بلدنا (8, 9, 13).

وفي بحث آخر مماثل أجري مؤخرا على 200 عينة حليب (من قطيع الماشية وبائعي الحليب) في نيجيريا، كان ما مجموعه 13.5 في المائة من العينات المضادة لبروسلا (14)- لأمراض بروسلا في الحيوانات أثر اقتصادي كبير، لا سيما في البلدان النامية، لأنها تتسبب في الإجهاض في الحيوانات الحامل وتقليص إنتاج الحليب (2)المرض غير عادي في البلدان الصناعية بسبب الفحص العادي لبرامج تطعيم الحيوانات والماشية المنزلية (15)على أي حال، لم يعد مسموحاً بتطبيق اللقاحات بشكل روتيني ضد الفرشاة، على الرغم من أن التطعيم يمكن أن يتفاعل مع برنامج المراقبة، تم وضع عدة نهج لحل هذه الصعوبة (16)- تستخدم السمات النباتية عادة لتحديد الأنواع البروسلية وتفريقها بشكل روتيني، ولكنها ترتبط بمخاطر عالية بالإصابة في عمال المختبرات وتستغرق وقتا طويلا. Also the rate of false negative in these tests are high e.g MRT with a sensitivity of 87.5% (3, 9)- وفي الآونة الأخيرة، أنشئت تقنيات التشخيص الجزيئية، مثل المقالات ذات الوقت الحقيقي (أداة دقيقة ونهائية وسريعة للتشخيص المبكر للمرض) لاكتشاف أنواع بروسلا (9)وهذه القياسات السهلة الأداء حساسة للغاية وتوفر مزيدا من التحديد لاكتشاف الكائنات المجهرية (17).

The aim of the current study was direct detection of B.melitensis and abortus by B.

تقنية PCR في الوقت الحقيقي في الحليب الخام ومنتجات الحليب لمصانع المعالجة الصغيرة والكبيرة والأسواق في مقاطعة إصفهان.

تصميم الدراسة

مجال جمع العينات ودراستها

وقد أُجريت هذه الدراسة الجزئية الشاملة لمعرفة مدى انتشار البروسية في إصفهان، إيران. ولهذا الغرض، تم جمع 132 عينة حليب و 65 منتجاً مختلفاً للحليب (8 عينات من الجبن التقليدي، و 21 عينة من الآيس كريم، و 8 عينات من الفضائح، و 13 عينة من الزبدة 1 من اليوغرت، وعينة واحدة من الزيت) عشوائياً من مختلف أسواق الحليب التي تبيع منتجات حليب وحليب غير معدة، ومزارع حيوانات تقع في 7 مدن صغيرة، منها لينيخان (33 حليب) وبلغت فترة جمع العينات حوالي شهرين (من أيار/مايو إلى حزيران/يونيه 2012). For investigating of the presence of B. abortus and B.melitensis by the Real Time PCR technique, 15 ml of milk and were collected into sterile 25ml falcon tubes with da caps. The samples were then taken to the laboratory of the infectious disease research center of Isfahan city in a cold chain where they were tested on the same day of collection after being allowed to rest for at least one hour.

Exction of Genomic DNA from Milk Samples

تم استخراج الحمض النووي الجينومي الإجمالي من الحليب ومنتجات الألبان باستخدام طريقة معدلة لكلوروفورم الفينول. واحد ملليمتر من منتج الألبان كان مختلطاً مع 50 ميكرول 20% من الدي دي إس كعامل تنكر The mixture was cooled after incubation at 72 °C for 15 min. وأضيفت النازة ألف (75 ميكروغرام/ميل) والبروتيناس K (650 ميكروغرام/ملتر) وأبقيت المخلوط عند 50 درجة مئوية مقابل 1.5 ساعة. ثم أُضيفت كحول إيسواميل (25:24: 1) وهزت لـ 20 من الحرق المركزي في 14000 ريم لـ 10 دقائق. The supernatant was transferred into a fresh tube and equal volume Chloroform: Isoamyle alcohol (24: 1) were added to all tubes, then shaked for 30s and centrifuged at 14000 rpm for 15 min. تم نقل السوبرانت إلى أنبوب طازج وتهيأ مع الإيزوبروبانول تم غسل الفول السوداني بنسبة 70 في المائة من الإيثانول ثلاث مرات جففت وعلقت في 50 ميكرولت من TE العازلة (4).

طراز PCR Assay

وقد تم تضخيم الوقت الحقيقي في حجم رد فعل إجمالي قدره 25 ميكرول يحتوي على 12.5 ميكرول تاكمان من مارك ماستر مييكس (Metabion International AG Germany)، وهو تركيز قدره 300 ميغاواط لكل محرك للأمام وعكس اتجاهي (Metabion International AG Germany)، وهو تركيز يبلغ 200 ميغا مترا من المسبار (Metabion International AG Germany)، و 5 ميكروب من الحمض النووي. تم تنفيذ عملية إعادة التأهيل في الوقت الحقيقي في نظام إعادة التشغيل في الزمن الحقيقي وفقا لبروتوكول الصانع (18)BMEII0466 gene for B.melitensis and BruAb2 0168 gene for B.abortus were chosen for the construction of primers and TaqManR probes for species differentiation (unique genetic loci of B.Melitensis and B.abortus)(Table 1).

النتائج

In the current study, 132 unpasteurized milk samples and 65 unpasteurized milk product specimens were tested by using real time PCR method for identification and differentiation of B.melitensis and B.abortus. The presence of Brucella DNA was detected by IS711 in 4 of 132 milk (3%) and 1 of 65 milk products samples (1.5%). وكانت نتائج انتشار بروسلا جينوس في عينات اللبن في مدينتي لينيان وخانسار هي 3 و 1 عينات على التوالي. منتج الألبان الإيجابي الوحيد كان زيت تقليدي كان من لينيان After real-time PCR with the BMEII0466 and BruAb2-0168 genes all of the 4 positive samples recognized as B. melitensis. لم يكن أي من العينات ايجابية لب. وقد اكتشفنا وجود ارتباط مباشر وغير كامل بين اللبن أو منتجات الحليب المصابة بالبروسيلا والمدن المختلفة (r:0.024, p:0.78).

المناقشة

In our country many cases of Brucellosis caused by B.abortus and B. melitensis that arise from occupational or contact with contaminated animals. المصادر الرئيسية للدماغ البشري للسكان العالميين العاديين هي حليب أو منتجات الألبان المجهزة من الحليب الخام ومشتقاته (9)- للنظافة الصحية البيطرية دور هام في مكافحة الرضوض والقضاء على هذا المرض الحيواني في الحيوانات لأنه يمثل خطوة أساسية لمكافحة المرض في البشر (19).

وقد أظهرت نتائج هذه الدراسة أن الانتشار العام للبروسيلا في عينات الحليب الخام وغيرها من منتجات الحليب في محافظتنا كان 3 في المائة و 1.5 في المائة على التوالي. There was no significant relation between the places of sample gathering (different small cities or animals farm) and contaminated milks (p of0.05). وكشفت هذه النتائج عن مشكلة هامة وخطيرة في مجال الصحة العامة. However the disease prevalence in cattle has been reported to be quite high in our country, reported different prevalence rates of brucellosis in different regions (ranges between 1.2% in urmia to 29.8% in shahekord) had no significance relation with weather condition in different seasons (13)وقد أفيد بأن استهلاك الحليب الخام أو منتجات الألبان المعدة في ظروف غير ملائمة هو الذي يتحمل مسؤولية نحو 40 في المائة من حالات الإصابة بداء الكدمات البشرية في تركيا (9).

B.melitensis is the major origin of human outbreaks of brucellosis worldwide. For example in some countries including Italy 99% of human brucellosis is caused by B. melitensis (2)ووفقا لهذه الدراسات في هذه الدراسة، لم نتمكن من العثور على أي سلالة إيجابية. The prevalence of human brucellosis obtained from milk or milk products in some countries is seasonal and in some seasons especially after rain and lambing reaching a top (2)ولم نتمكن من التحقيق في هذا الموضوع بسبب فترة محدودة من أخذ العينات، وهي إحدى القيود المفروضة على الدراسة الحالية. وعلى الرغم من أن التشخيص العصبي للدماغ يحتاج إلى استخدام أكثر من اختبار واحد، فإنه لا يمكن إجراء تحليل غير مباشر للحليب ELISA بسبب عدم توافر مجموعات الاختبارات. ولا تستخدم اختبارات أخرى مثل RBPT و CFT و SAT إلا لاختبار عينات المصل وبالتالي فهي غير ملائمة لاختبار الحليب. The sensitivity of MRT was 87.5% while its specificity was 98.6% (14).

التقنيات الجزيئية هي بدائل أملية للمسببات المرضية التي تثير المشاكل مثل بروسيليا (8)وفي معظم الدراسات المماثلة السابقة التي أجريت على منتجات الألبان، لا سيما في جمهورية إيران الإسلامية، تُجرى نتائج إيجابية أو سلبية زائفة. وهذا هو التقرير الأول عن الكشف عن عدوى الفروسيلا في الحليب ومنتجات الحليب الأخرى بطريقة حساسة للغاية في بلدنا. إن استهلاك منتجات الألبان غير المصححة أو الحليب المخصب غير المكبوت هو السبب الرئيسي للإصابة بالوباء لأن الحليب وغيره من منتجات الألبان غير المصحوبة قد تحتوي على أعداد كبيرة من الكائنات الحية المجدية والمعدية (9, 14).

وقد أشارت نتائج مختلف الدراسات الوبائية عن فرط الدم البشري إلى أن استهلاك منتجات الألبان الخام هو المصدر الأكثر احتمالاً لالتهاب بروسلا وعامل خطر كبير في المنطقة الحضرية بالنسبة للدماغ البشري. (20)- وتراوحت نسبة انتشار الرضوض البشري في مختلف أنحاء إيران من 1.5 إلى 107.5 في المائة لكل 000 100 (في حمدان) في عام 2003، وبالتالي يمكن أن تشكل تهديدا لصحة المنتجين في المناطق الريفية، ولا سيما النساء والأطفال (8).

لذا ينبغي التوصية بشدة بتعقيم الحليب ومنتجات الألبان، والتعلم لتجنب استهلاك الحليب غير المغذي ومنتجات الحليب، وتطعيم القطيع، وإزالة الحيوانات المصابة. (9)ومن الضروري أيضاً إجراء مراقبة ناجحة لبرنامج مراقبة الرضّع لتحديد مدى انتشار الفرشاة في القطيع. وستنشئ هذه الترتيبات المعلومات الأساسية للإشراف على التقدم المحرز في برامج المراقبة التالية.

خاتمة

ويمكن استنتاج من هذه الدراسة أن انتشار اللبن المصاب في مقاطعة إصفهان يكاد يكون مرتفعاً، ولذلك ينبغي إجراء دراسات أكثر وصفاً (مثل التحقيق في منتجات الألبان في مواسم مختلفة) في هذه المنطقة لجعل وسائل التحكم الملائمة والفعالة. وتشير نتائجنا أيضاً إلى أن عملية إعادة التأهيل في الوقت الحقيقي يمكن أن تكون أداة قوية لتشخيص الرضوض والتفريق بين B. melitensis و B. abortus.